22/06/15Catturare la luce fuori fuoco è una sfida per ottenere immagini nitide e ad alto contrasto in molte applicazioni di imaging. La microscopia digitale a foglio di luce scansionata (DSLM) offre un modo efficace per ridurre la cattura della luce fuori fuoco sincronizzando l'illuminazione con l'otturatore rotante delle moderne fotocamere CMOS. Tuttavia, questa sincronizzazione precisa richiede il controllo completo sul funzionamento dell'otturatore rotante della fotocamera, una funzionalità offerta dalle fotocamere Tucsen con modalità di controllo dell'otturatore rotante.
Che cosa è la tapparella?
L'otturatore è la parte della fotocamera che avvia e arresta l'esposizione alla luce. In passato, le fotocamere scientifiche utilizzavano otturatori meccanici, che si aprivano per esporre un'immagine e si chiudevano per terminare l'esposizione. Gli otturatori meccanici erano lenti e soggetti a problemi di affidabilità con l'uso prolungato. Ora, le fotocamere scientifiche utilizzano otturatori elettronici, che sono significativamente più veloci, semplici e versatili.
Le telecamere a otturatore rotante iniziano l'acquisizione dalla parte superiore del sensore e "scorrono" verso il basso, riga per riga, fino alla parte inferiore del sensore. Questa acquisizione prevede tre processi: reset del segnale, esposizione alla luce e lettura.
L'esposizione di ogni riga inizia con il reset del segnale acquisito di ciascun pixel. Trascorso il tempo di esposizione designato per la riga superiore, la lettura, che segna la fine dell'acquisizione, scorre verso il basso nello stesso modo. Questo lascia un'area di pixel attivi che si estende dall'alto verso il basso della telecamera, con un'altezza determinata dalla durata del tempo di esposizione. Con la telecamera in funzione alla massima velocità, il ritardo per linea è in genere compreso tra 5 e 25 microsecondi per linea di pixel, a seconda della velocità della telecamera.
Per sfruttare al meglio le tecniche ottiche che richiedono la sincronizzazione della scansione dell'illuminazione e dell'otturatore rotante della fotocamera, in genere questo ritardo è troppo breve, il che significa che l'otturatore rotante funziona troppo rapidamente perché altri hardware possano tenere il passo. È qui che entra in gioco la modalità di controllo dell'otturatore rotante.
Figura 1: Schema di funzionamento della serranda avvolgibile
Come funziona la modalità di controllo delle tapparelle
Grazie all'intelligenza integrata nelle telecamere Tucsen, il funzionamento dell'otturatore rotante della telecamera può essere regolato con precisione per sincronizzarsi con l'hardware esterno. Aggiungendo un piccolo ritardo aggiuntivo tra il reset e la lettura di ciascuna linea, è possibile controllare il tempo impiegato dall'area del pixel attivo per scorrere lungo il sensore, consentendo questa sincronizzazione.
Inoltre, l'altezza della fessura dell'area attiva scansionata può essere regolata con precisione. Tempi di esposizione più lunghi o ritardi di linea più brevi determinano un'altezza della fessura maggiore. Nel caso della DSLM, questo può essere utilizzato per adattare solo l'area illuminata del campione, trovando un equilibrio tra l'esposizione dei pixel per il massimo tempo possibile per un'efficace acquisizione del segnale e la riduzione al minimo della luce fuori fuoco.
Figura2: A sinistra: Schema del funzionamento dell'otturatore rotante alla massima velocità della telecamera. A destra: Schema che mostra la velocità dell'otturatore rotante con la modalità di controllo dell'otturatore rotante che aggiunge un ritardo aggiuntivo tra ogni linea per consentire la sincronizzazione con altro hardware.
Con questo ritardo opzionale, ora ci sono tre variabili importanti da comprendere che determinano il funzionamento dell'otturatore rotante, indicando l'altezza dell'area dei pixel "attivi" e la velocità con cui attraversa il sensore.
Tempo di linea: Questo è il tempo predefinito impiegato dal sensore per leggere una riga e passare a quella successiva. Determina la "velocità" nativa del sensore della fotocamera e può essere specificato nel software della fotocamera o approssimato per una determinata regione di interesse (ROI) e modalità della fotocamera tramite:
Dove "Frequenza fotogrammi massima della telecamera" si riferisce alla frequenza fotogrammi quando non è limitata dalla durata del tempo di esposizione o dalla frequenza di attivazione esterna.
Tempo di esposizione:Ciò determina per quanto tempo ogni riga di pixel è attiva, determinando così l'altezza dell'area attiva per un dato tempo di linea e tempo di ritardo.
Ritardo della linea:Questo è il ritardo aggiuntivo aggiunto dalla modalità di controllo della tapparella. La modalità di controllo della tapparella consente di aggiungere un ritardoin multipli interi del tempo di lineaAd esempio, se il tempo di linea per una telecamera è di 10 microsecondi, un ritardo aggiuntivo per linea di 1, 2,…si possono aggiungere fino a 8.928, indicando il numero di multipli di 10 microsecondi.
Altrettanto importante è l'altezza della regione di interesse (ROI) utilizzata, poiché determinerà il numero di linee che l'area attiva deve percorrere prima di essere reimpostata.
Modalità di sincronizzazione della modalità di controllo delle tapparelle
Sono disponibili due modalità di funzionamento per la modalità di controllo delle tapparelle, a seconda della variabile più importante da controllare.
In Modalità di ritardo temporale della linea, è possibile impostare il tempo di ritardo come specificato sopra. Il software può quindi indicare, per il tempo di esposizione specificato, quale sarà l'altezza della fessura risultante, ovvero l'altezza dei pixel attivi nell'otturatore rotante.
In Pixel attivo / Altezza fessuraIn modalità "Slot", è possibile impostare il numero di file del sensore che si desidera siano attive durante la scansione dell'otturatore. Il tempo di esposizione specificato verrà quindi utilizzato per calcolare il ritardo di linea richiesto per fornire automaticamente questa altezza di fessura.
Impostazione della modalità di controllo delle tapparelle nel software
Controlli della modalità operativa (stato)
Figura 3: Esempio di interfaccia per il controllo della modalità di controllo delle tapparelle dal software Tucsen Mosaic. Tutte le opzioni disponibile tramite Micro-Manager e SDK.
Sono disponibili tre stati (modalità operative):Off, Ritardo di linea, Altezza della fessura.
• Quando impostato suSpento, il sensore si comporta normalmente senza alcun ritardo aggiuntivo.
• Quando impostato suRitardo di lineamodalità, è possibile specificare il ritardo della linea in unità di tempo della linea, come spiegato sopra.
Figura 4: Opzioni software Line Time Delay. Esempiointerfaccia del software Tucsen Mosaic. Tutte le opzioni disponibili tramite Micro-Manager e SDK.
Il numero di cicli di tempo di linea che possono essere aggiunti al ritardo configurabile varia da telecamera a telecamera. Il nuovo tempo di linea della telecamera, dopo l'aggiunta del ritardo, è quindi:
Intervallo di tempo di linea = Tempo di linea(sensore)+（Tempo di linea(sensore)× Ritardo di linea）
Il valore del parametro diVelocità di rotolamentoè uguale aTempo di intervallo di riga.
Il tempo totale di lettura dell'immagine è quindi:
Rtestafuori tempo(immagine)= Tempo di intervallo di riga×Nrighe.
Nrigheè il numero totale di righe di pixel di imaging nella regione di interesse. Il frame rate durante l'imaging in questa modalità dipende dal numero di linee da acquisire e dal tempo di ciclo della linea:
Frequenza dei fotogrammi = 1/(Tempo di lettura(immagine)+ Tempo di esposizione)
•Quando impostato suAltezza della fessura mode, puoi impostare ildimensione dell'area attiva scansionata, data da til numero di righe di pixel tra il segnale di "reset" e il segnale di "lettura".L'intervallo di altezza della fessura è 1~2048, in unità pixel. Per convertire questo valore in una dimensione fisica, moltiplicare questo valore per la dimensione in pixel indicata sulla scheda tecnica della fotocamera.
Figura 5: Opzioni di controllo della modalità Altezza fessura. Esempiointerfaccia del software Tucsen Mosaic. Tutte le opzioni disponibili tramite Micro-Manager e SDK.
Il software calcolerà automaticamente il ritardo di linea e l'intervallo di linea richiesti, la formula è la seguente:
Ritardo temporale della linea = Tempo di esposizione(Linee)/ Altezza della fessura(Linee)
In modalità Alta Velocità (modalità guadagno della telecamera), l'intervallo di altezza della fessura può essere impostato solo su un numero pari, poiché in tale modalità le linee vengono lette due a due. I parametri in modalità Alta Velocità vengono calcolati come segue.
Ritardo temporale della linea = Tempo di esposizione(Linee)/ ½Altezza fessura(Linee)
Altezza della fessura = （Tempo di esposizione(Linee)÷ Ritardo di linea）×2
Controlli della direzione di scansione
Per la direzione della tapparella sono disponibili tre opzioni:
DProprio：La direzione di scansione verso il basso è la direzione di scansione predefinita per le telecamere sCMOS. L'otturatore rotante inizia dalla prima riga in alto del sensore e scansiona verso il basso fino all'ultima riga in basso. Ogni successiva acquisizione di fotogrammi inizia dalla prima riga in alto.
Figura 6: Schema della modalità di scansione verso il basso
Up：Nella modalità di scansione verso l'alto, l'otturatore rotante inizia dalla riga inferiore e scansiona fino alla riga superiore della prima riga. Ogni successiva acquisizione di fotogrammi inizia dalla riga inferiore. Sebbene l'ordine di acquisizione dei dati sulla fotocamera sia ora invertito, l'immagine risultante inviata al software mostrerà comunque l'orientamento originale, ovvero l'immagine non verrà capovolta verticalmente rispetto alla modalità di scansione verso il basso.
Figura 7: Schema della modalità di scansione verso l'alto
Ciclo discendente-ascendente：Quando si esegue la scansione alternativamente verso l'alto e verso il basso, l'otturatore rotante inizia dalla prima riga in alto e scende fino all'ultima riga in basso. Per il fotogramma successivo, l'otturatore rotante inizia dalla riga in basso e scansiona fino alla riga in alto, e così via. L'orientamento dell'immagine acquisita in questa modalità è lo stesso della scansione verso il basso.
Figura 8: Schema della modalità di scansione del ciclo Down-Up
• Readout Direzione Reset
Questa funzione è disponibile solo in modalità Ciclo Down-Up.
L'impostazione predefinita per questo parametro è "Sì", che garantisce che il primo fotogramma di ogni nuova sequenza di acquisizione inizi dalla riga più in alto e proceda verso il basso.
Quando questo parametro è impostato su "No", il primo fotogramma di ogni nuova acquisizione inizierà nella posizione dell'ultimo fotogramma della sequenza precedente. Se l'ultimo fotogramma termina nella riga inferiore, il primo fotogramma delle acquisizioni successive inizierà nella riga inferiore e si propagherà verso l'alto.
